蓝莓组培技术

    蓝莓组培
    一、实验室设计
    1.准备室:(1)进行药品的保存、配置、消毒、分装等。(2)器具的洗涤、干燥、消毒。(3)生理生化指标的测定等。
    2.接种室：进行材料的接种，内置超净工作台或接种箱。外设缓冲间-放置拖鞋、工作服、工作帽等。
    3.培养室：植物材料的无菌培养，室内主要有培养架和控制温度及光照的设备。
    4.细胞学观察实验室：进行培养材料的组织学、细胞学、观察照相等。
    二、常用设备和器材
    1.高压蒸气灭菌锅：用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。
    2.超菌工作台：用于培养物的无菌操作。（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）
    3.接种工具：包括双筒实体显微镜、镊子、剪刀、解剖刀、洒精灯等。
    4.培养设备：包括空调机、定时器、温度控制器、增湿机或去湿机、培养架、摇床或旋转床、日光灯、光照培养箱等。
    5.化学实验及分析设备：包括天平、酸度计、蒸馏水器、烘箱或玻璃仪器烘干器、电炉、药品柜、冰箱、晾干架等
    高压灭菌锅手提式灭菌锅培养箱超净工作台烘干箱电子天秤
    三、玻璃器皿的选择和清洗
    1.玻璃器皿的选择
    *试管-适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。
    *三角锥瓶-适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。
    *L形管和T形管-为专用的旋转式液体培养试管。
    *培养皿-适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。
    *角形培养瓶和圆形培养瓶-适用于液体培养用，如单细胞和原生质体的浅层培养。
    *果酱瓶-常用作试管苗大量养殖用的培养瓶。
    2.玻璃器皿的清洗
    （1）清洗玻璃器皿用的洗涤剂有肥皂、洗洁精、洗衣粉、和铬酸钾洗涤液。
    （2）清洗时先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用热的肥皂水或洗洁精洗净，清水冲洗干净后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。
    （3）洗净的玻璃器皿应透明发亮、内外壁水膜均匀，不挂水珠。
    四、影响植物组培的因素
    1.植物因素：(1)基因型，(2)植物年龄，(3)组织和器官的年龄，(4)植物的生理状态，(5)取材年份及生长条件，(6)取材部位及大小。
    2.培养基因素：无机盐、有机化合物、植物激素、天然提取物、琼脂、PH值、渗透压、活性炭。植物组织培养的成功与否，除了培养材料本身的因素外，很大程度上取决于对培养基的选择。培养基的种类、成份等直接影响培养材料的生长发育。故应根据培养材料的种类和部位，选取适宜的培养基。
    3.外植体的选择和灭菌:不同品种、不同器官之间的分化能力有差别，且组织培养是建立在无菌操作基础之上的专门技术，因此在进行植物组织培养时，必须选择合适的外植体进行灭菌操作，以确保组织培养工作的顺利进行。
    4.环境因素：(1)光照：包括光强、光质、光周期，(2)温度，(3)湿度，(4)气体。
    五、培养基的主要成分及制作程序
    （一）、培养基的主要成分：
    1.无机盐：(1)大量元素：C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl。(2)微量元素：Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na。(3)水：培养基95%是水，应使用蒸馏水、双蒸水或使用去离子水,水应放在塑料容器中。
    2.有机化合物：(1)糖(碳源和能源)，(2)维生素类：有维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等，(3)氨基酸类(有机氮源)。
    3.植物激素（生长调节物质）：
    （1）生长素：主要包括IAA（吲哚乙酸）、NAA（萘乙酸）、2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、IBA（吲哚丁酸）；它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生；作用的强弱顺序为：2，4-D>NAA>IBA>IAA。
    （2）细胞分裂素：天然：6-BA（6－苄基酰嘌呤）、KT（激动素，糠基酰嘌呤）；人工：ZT（玉米素）、2-iP（2-异戊烯酰嘌呤）；它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用；作用的强弱顺序为：TDZ,4PU>ZT>2-iP>6-BA>KT。
    （3）赤霉素：GA3。
    （4）乙烯及乙烯抑制剂。
    4.天然提取物（如椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥等），其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。
    5.琼脂（是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物），其主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢。
    6.活性炭：加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。
    （二）、1962年Marshing和Shong发明了MS培养基
    （三）、培养基的制作程序：
    六、外植体的选择和灭菌
    （一）、外植体的选择:(1)外植体部位;(2)取材季节;(3)器官和生理状态和发育年龄;(4)外植体的大小。
    （二）、外植体的灭菌方法
    1、常用灭菌药剂的使用和效果：
    消毒剂使用浓度/%清除难易消毒时间/min灭菌效果
    次氯酸钠2易5-30很好
    次氯酸钙9-10易5-30很好
    漂白粉饱和溶液易5-30很好
    升汞0.1-1较难2-10最好
    酒精70-75易0.2-2好
    过氧化氢10-12最易5-15好
    溴水1-2易2-10很好
    硝酸银1较难5-30好
    抗菌素4-50mg/L中30-60较好
    2.灭菌方法:
    （1）茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗---75%酒精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次---Naclo或升汞溶液泡10-15min---无菌水洗3-4次
    （2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min---70%酒精漂洗---2%Naclo液浸10min---无菌水2-3次---取出种子培养
    （3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗---纯酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---无菌水洗3次
    （4）花药的消毒：70%酒精浸泡数秒钟---无菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次。
    七、外植体接种和培养
    1.外植体的接种
    （1）接种室的消毒:用70%酒精喷雾使细菌和真菌孢子随灰尘的沉降而沉降,再用紫外灯照射20min；或用高锰酸钾与甲醛蒸气熏蒸。超净工作台可用新吉尔灭或酒精擦洗，其它一切器皿、衣物都要经严格的灭菌才能带进接种室。
    （2）接种：左手拿试管或三角瓶，右手拿接种针或镊子接种，瓶口要靠近酒精灯火焰、接种动作要快，以免造成污染。
    2.培养方法
    （1）根据外植体不同可分为：胚胎培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养
    （2）根据培养方式不同可分为：固体培养、液体培养、半固体培养、双层培养
    3.培养条件：温度、湿度、光照、PH值、氧和其它气体
    4.外植体褐变及其防止:(1)培养基中加入抗氧化剂；(2)用抗氧化剂浸泡外植体后再接种；(3)减少光照强度或在黑暗条件下培养；(4)多次更换培养基达到稀释释效应；(5)加入多胺类物质，如精胺、亚精胺通过刺激细胞分裂，加速组织生长，减少褐化。
    5.试管植物的玻璃化现象及其预防措施
    外植体接种全过程
    酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min器械消毒酒精灯灼烧酒精擦拭培养皿
    酒精擦拭旋转灼烧修剪外植体取外植体接种塞回瓶塞培养