植物组织培养是指在无菌条件下,对离体植物组织(器官或细胞)分离并在培养基中培养,使其能够继续生长,甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性,即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组,因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞,一旦脱离原有的机体环境,成为离体状态,在适宜的营养和外界条件下,就会表现出全能性,从已经分化定型的细胞,脱分化,成为恢复分裂能力的细胞,并能重新生长发育成完整的植株。
二、试剂及仪器
(一)仪器设备
超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、人工气候箱、电子天平、移液器(1-5ml)、恒温磁力搅拌器、酸度计、手术刀、手术剪、称量纸、皮筋、封口膜、三角烧瓶(500ml、100ml)、量筒、烧杯(1000ml)、试剂瓶(1000ml、100ml)、长镊子、记号笔(或标签纸)、培养皿、酒精灯、打孔器
(二)试剂
75%酒精、次氯酸钠(或H2O2)、植物生长激素、蔗糖、脂粉、HCl、NaOH、KH2PO4、CoCl2?6H2O、烟酸、盐酸-硫胺素(VB1)、盐酸-吡哆醇(VB6)、肌醇、甘氨酸
三、实验步骤
(一)培养基配制
1.培养基的选择
植物组织培养中应用的培养基,一般由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质组成。
无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素:C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等,微量元素:Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般为蔗糖。维生素中只有硫胺素是必需的,而烟酸、维生素B6和肌醇对生长之起促进作用。常用的生长调节剂有IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、NAA(萘乙酸)、NOA(萘氧乙酸)、P-CPA(对氯苯氧乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)、2,4,5-T(三氯苯氧乙酸);BAP(苄氨基嘌呤)、6-BA(苄基腺嘌呤)、2-Zi(异戊烯氨基嘌呤)、KT(激动素)等。有机附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等,可促进分化,但如培养基配方适当,则大多数组织是不需要的。
培养基的种类、成份直接影响到培养材料的生长发育,故应根据培养植物的种类和部位,选择适宜的培养基。培养基种类繁多,最基本、最常用的培养基为MS培养基(见表1)。
2.培养基的配制
①先按表1配制MS培养基贮液,②再将贮液与其他成分按比例混合。③此外还需加入适量的蔗糖作为碳源,起支持作用的琼脂粉,适量的生长调节剂等。④将上述培养基加热溶解后,加蒸馏水使培养基达到终体积。⑤再用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl调节培养基的pH值至最适。⑥分装至三角烧瓶,封口膜封口,等待灭菌后使用。
3.几种诱导愈伤组织的培养基
胡萝卜MS+0.5mg/L6BA+0.5mg/LNAA
玫瑰叶盘,芽MS+0.5mg/L6BA+0.5mg/LNAA
烟草叶盘、叶柄MS+0.1mg/L6BA+0.5mg/LNAA
pH5.8,蔗糖30%,琼脂粉6.5g/L。
(二)灭菌
1.培养基及器具灭菌
培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度,常用的灭菌温度为121℃,所需时间应随要灭菌的液体的容积变化而变化(见表2)灭菌结束后待温度下降到50℃以下,才能取出已灭菌的培养基。
可用同样方法对器具同时进行灭菌,包括:培养皿、解剖刀、剪子、滤纸、镊子、打孔器等。
2.工作环境灭菌
接种前1h打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40min。杀菌结束后,先关掉棚面的紫外灯,再打开风机,最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息时,要先打开台面的紫外灯,再关风机,最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。
3.植物材料的灭菌
植株各部分的表面携带着各种微生物,他们是植物组培的污染源,所以在接种培养前必须进行彻底的表面消毒;组织内部侵染的真菌或细菌很难消除,这些组织一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢,再用无菌洁净滤纸吸干水分。