植物组织培养的技术原理

植物组织培养是指将植物体的一部分接种在合成培养基上，使其按照预定目标生长发育成新植株。近年来，花卉组织培养及快繁脱毒技术越来越多地应用于花卉种苗养殖生产中。　

　一、组织培养在花卉产业中的应用 1.快速、大量养殖优良品种组织培养技术已成为种苗生产的主要技术之一。经组织培养，可增加养殖系数，加快养殖速度，可生产出种性纯、品质好、产花量高的生产性用苗。在花卉育种过程中，不断的杂交、选种极大地扩展了花卉的花形与颜色，使得花卉在各方面都越来越接近人们的需求。但在同时，也造成了花卉基因类型的高度异质化———子代不易有均一表现。而组培苗是在母株器官、组织或细胞的基础上发展起来的，可以保持母株的全部特性（花形、花色、株形、开花习性、抗逆性等），因而可以根据需要来选择集多种优良性状于一体的植株加以分生，从而得到大量与母株一模一样的植株。　　

2.培育脱毒苗木采用组织培养技术，利用植株的分生组织不易感染病毒的原理，可以对花卉植株的分生组织进行组织培养来养殖苗木，防止亲代植株的病害传递给子代，从而达到脱毒的目的。　　

病毒病对长期应用营养养殖（分株、扦插等）的观赏植物及其生产的危害相当严重。由于观赏植物多采用营养养殖，如嫁接、分株、压条等方法养殖时，病毒（及类病毒）则通过营养体及刀具、土壤传递给后代，大大加速了病毒病的传播与积累，导致病毒病的危害越来越严重。据统计，观赏植物的病毒已多达100多种，并且逐年有新增病毒的报道。观赏植物因病毒病大大影响其观赏价值，表现在康乃馨、菊花、百合、风信子等的鳞茎、球茎与宿根类花卉及兰科植物等严重退化，花少且小，花朵畸形、变色，大大影响观赏价值，严重者甚至导致某些品种的灭绝，严重制约观赏植物生产的发展，这也是我国切花品种跨不出国门的原因之一。 组培快繁技术已应用到蝴蝶兰的栽培中 非洲菊也可以通过组培快繁技术进行养殖 　　

植物组织培养脱毒的原理主要是利用茎尖分生组织不带毒或少带毒。感病植株体内的病毒分布不均匀，其数量随植株部位和年龄而异，越靠近茎尖顶端的区域，病毒的浓度也越低。分生区域无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度，因此生长点含有病毒的数量极少，几乎检测不出病毒。因此，茎尖培养时，切取茎尖的大小对脱毒效果有很大影响，茎尖越小效果越佳，但太小时不易成活，过大则不能保证完全除去病毒。不同种类的植物和不同种类的病毒在茎尖培养时切取的茎尖大小也不相同。一般来说，切取0.2至0.5毫米带1至2个叶原基的茎尖进行培养即可。　　

3.保存种质资源常规有性养殖往往会造成大小不一的变异，如红色可能变异成粉红色等。组织培养不存在变异，可保持原母本的一切遗传特性，防止种质资源的退化。很多无性养殖的植物因没有种子，无法长期保存，其种质资源传统上只能在田间种植保存，耗费人力物力，且资源易受人为因素和环境因素影响而丢失。而用组培方法保存，可大大节省人力、物力，并延长保存期，保证种质资源不会突变和流失。　

　4.花卉育种在花卉育种上，主要在胚胎培养、单倍体育种、体细胞杂交和植物基因工程等方面应用较多，此外还可采用愈伤组织诱变、花粉培养等多种方法来进行花卉育种。通过组织培养，可缩短育种年限和世代，也有利于基因突变中隐性突变的分离。利用组织培养技术可以对花粉和花药进行培养，得到单倍体植株，从而缩短了育种周期，尤其是对木本的花卉育种特别有意义。　　

（1）无性系变异的利用植物细胞或原生质体经愈伤组织诱导再生植株的过程中，可能伴随着广泛的变异，这种变异称为体细胞无性系变异。植物体细胞无性系变异是遗传变异的重要来源之一，它具有变异广泛、后代较稳定、基本保持原品种特性等优点。　　

（2）远缘杂交种后代的获得百合、鸢尾等许多花卉虽然可以进行远缘杂交，但是由于生理代谢等方面的原因，常使杂种胚早期败育，因而得不到杂种植物。而在试管中进行胚培养，可使其顺利生长，得到远缘杂种。　　

（3）草花育种组织培养是应用较早，比较成熟的一项技术，在草花育种中主要用作其他育种手段的辅助技术。例如，当某一变异植株上具有优良性状而尚未确定该性状能否遗传时，可用茎尖组培技术扩繁，增加供试材料，防止有益变异的组织丢失。另外，诱导胚状体过程中常产生变异，因而组培也是一种引发变异的育种手段。同时，细胞在离体培养过程中会产生广泛的无性系变异，通过协迫培养，可以获得具有相应耐性的愈伤组织，诱导产生再生体植株，从而获得耐性遗传。　　

（4）花卉品种的提纯复壮运用组织培养，苗木的复壮过程很明显，对于长期运用无性方法养殖并开始退化的花卉品种，如康乃馨采用组培方法养殖，可使个体发育向年轻阶段转化。　　

二、花卉组织培养的途径 1.生长点途径通过诱导茎尖或侧芽，形成大量腋芽，从而获得大量幼小植株。此途径产生变异的机会较小，所获瓶苗的品质也较均匀。多数花卉植物的组培苗都采用这一途径进行快速养殖。　　

2.胚状体途径通过诱导植物体细胞或组织产生胚状体，再由胚状体发育成大量植株。此途径较易产生变异。一品红、苏铁等通常采用此途径进行繁育。　

　3.愈伤组织途径外植体经植物生长调节剂处理后先形成愈伤组织，再经器官分化形成许多芽体，达到大量养殖的目的。此途径产生变异的机会比其他两种途径都大。　　

三、组织培养对实验室的要求花卉组织培养是在人工控制的条件下培养花卉，是一种花卉现代工厂化生产新技术，所以其对实验室及设备有一定的要求。　　1.实验室方面

（1）化学实验室：主要承担配制培养基的任务。要求具有各种化学药品试剂、各种玻璃器皿、称量天平等。　　

（2）准备室：主要进行玻璃器皿的洗涤，要求有上下水装置。进行培养基础用具的消毒。要有高压灭菌锅，具有水源和电源。　　

（3）接种室：是花卉材料分离、消毒接种和转移的场所。要求密闭、清洁、整齐，装有紫外灯，能随时灭菌。　　

（4）培养室：是花卉材料培养生长的地方。要求清洁、保温好、室温均匀一致，并有绝热、防火性能。　　

为了保证接种室和培养室清洁无菌以及减少由于环境污染进而导致培养基污染而造成的浪费，建议最好安装十万级的净化设备，用物理灭菌手段代替化学灭菌，达到减少环境污染，实现可持续发展。　　

2.设备方面（1）天平：供配制培养基时称量药品和激素用。大量元素用普通天平；微量元素和激素用分析天平。　　

（2）酸度计：测定培养基的pH值。　　

（3）高压灭菌锅：用来供培养基和器械用具灭菌。　　

（4）烘箱：用于洗净的玻璃器皿干燥灭菌。　　

（5）蒸馏水制造装置：用来得到纯净水，供培养用。　　

（6）冰箱：供贮放母液和植物材料用。　　

（7）接种箱或超净工作台：为植物材料接种或转移的操作场所。　　

（8）空调机：控制室温用。四、花卉组织培养对培养基的要求培养基是花卉植物组织培养中十分重要的基质，目前应用的有很多种，但其主要成分大体相同。除主要成分是水外，其他还有大量元素、微量元素、维生素、生长调节物质、蔗糖和琼脂等。　　

目前花卉组织培养中应用最多的为MS培养基。其组成是在配制1升培养基时，加硝酸铵1.65克、硝酸钾1.9克、氯化钙0.44克、硫酸镁0.37克、磷酸二氢钾0.17克、碘化钾0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸镁22.3毫克、硫酸锌3.6毫克、铂酸钠0.25毫克、硫酸铜0.025毫克、氯化钴0.025毫克、硫酸铁27.8毫克、蔗糖20至40克和琼脂4至10克。其他生长调节物质要根据花卉的种类和培养目的而确定。　　

配制培养基前要准备好烧杯、量筒、吸管、容量瓶等玻璃仪器，预先称好药品用蒸馏水溶解，分别配制成10倍或100倍母液备用。配制培养基时准备好培养瓶，可以是三角瓶也可以用目前市场上推出的塑料瓶、大烧杯、分液器等仪器，配制时先将琼脂溶化，再加入各种母液和蔗糖，然后用1摩尔的氢氧化钠或盐酸调整培养基的pH值，一般掌握在5.8左右。以后可分注到培养瓶中，盖好瓶盖。培养基配好要经高压灭菌，冷却后放到培养室预培养3天，如没有杂菌污染，才可进行花卉材料的接种。　　

五、组培法养殖花卉的基本阶段

1.外植体材料的选取从理论上讲，越是具有全能性的部位其组培的成功性就越高。植物具有全能性的细胞通常有三类：一是受精卵；二是发育中的分生组织细胞，即分生组织、根尖、嫩茎、幼叶、花等；三是雌雄配子及单倍体细胞。　　

对大多数种子植物来说，茎尖是最好的部位，但往往受到材料来源的限制，为此茎段也得到了彻底的应用，而叶片的培养利用更为普遍，材料来源也较丰富。子叶和下胚轴的培养对于难培养的植物很有效，花粉和花药培养则成为育种和脱毒苗获取的重要途径之一。　　

选材时应注意选取带菌少、生长时间短、生长旺盛的材料，还应注意取材的时期。大多数植物应在生长开始的季节进行采样，生长末期或休眠期的外植体对诱导反应迟饨。器官的状态也有影响，沿花卉的主轴，越往上的部位经组培形成的器官其生长的时间越短且越易形成花器官；而下部组织产生营养组织的比例较高。　　

2.材料的灭菌处理花卉植物组织培养即无菌培养，也就是要求培养的材料不带有杂菌。从田间或温室等地切取花卉材料时，应选择健壮无病虫母株，取幼嫩、分生能力强的部位，以利生长。　　

取来的材料虽经选择，外部总还有不少杂菌。为此，接种前应进行表面灭菌。通常先用自来水冲洗十几分钟，把泥刷去。冲洗干净后，用70％的酒精浸泡10至15秒钟消毒。接着用无菌水（经高压灭菌的蒸馏水）冲洗两次，再用10％的漂白粉澄清液浸泡20分钟消毒或用0.1％的氯化汞浸泡3至15分钟，最后用无菌水冲洗3至4次。带有茸毛不易湿润消毒的材料可加些洗衣粉。上述操作皆应在接种箱或超净工作台等无菌环境条件进行。经过表面灭菌的材料，用无菌滤纸将水吸掉，再用解剖刀切取所需部位，通常几毫米大小即可。培育无病毒苗则应在1毫米以下，然后用解剖针或枪式镊子将材料接种到培养瓶内。工具用完即应在95％酒精中蘸一下，用干热灭菌器或用火焰消毒法消毒，避免工具带菌造成交叉污染。操作时应穿工作服、戴工作帽，事先洗净手，然后再用酒精棉擦拭一遍。　　

3.无菌培养体系的建立选择健壮无病虫害的花卉植物母株，种植于室内或温室中经过蒸汽消毒的培养基上，2至4周后，再从母株上采取刚生长不久的茎顶或芽体（这些部位分生能力强且不易受污染）。茎顶或芽体以清水洗涤干净后，先用70％（体积数，下同）的酒精表面消毒15至30秒，再用1.0克/升的升汞（HgCl　2）溶液（以浸没茎顶或芽体为准）消毒10分钟左右，然后，再用无菌水冲洗5至7次。在超净台内，先用无菌滤纸吸干茎顶或芽体表面的水分，然后摘取适当大小的茎尖或芽体于诱芽培养基中培养。　　

诱芽培养基可采用基本培养基　　MS，生根培养基可用1/2MS。激素可控制在6－BA（6－卞基腺嘌呤）1至5毫克/升，NAA（萘乙酸）0.1至0.5毫克/升范围内。诱芽、生根培养基附加的蔗糖量分别为30克/升和15克/升左右，琼脂7至8克/升，pH值为5.7至5.8。培养温度为23℃至27℃。光照时间每天为10至14小时，光照强度为1000至2000勒克斯。　　

4.丛生芽的分化及增殖筛选合适的培养基进行芽分化及增殖培养，而后继代培养，以使外植体在短期内产生大量不定芽。　　

花卉材料接种后放到培养室培养。培养室是花卉材料培养生长的场所，一般几至十几平方米皆可。高度约2米左右，空间小，可节省控温能源。把培养材料放在培养架上培养。培养架可由木材或金属制成，4至5层，每层高40至50厘米，常规方法是将日光灯装在上方。架长1.2米左右，与40瓦日光灯长度一致，宽80至90厘米。每一层可装2盏日光灯，这样培养时的照度约为3000勒克斯。　　

目前市场上有一种加入稀土的植物培养补光灯，一盏灯的亮度和强度相当于两盏日光灯。经过实验，这种灯下培养的植物叶片或茎中的色素形成充分，对植物生长有利，值得推广。另外，可以节约一倍多的能源，不但降低散热，也可减少空调的工作强度，从而大大降低培养成本。　　

培养室大多采取昼夜恒温培养，其温度为25℃±2℃，也有采取昼夜变温培养的，夜晚温度可低些，这应根据花卉生长需要而定。每天灯光照明12至16小时。　　

5.壮苗生根增殖养殖所得到的不定芽，要转移到不含任何激素，或者不含任何细胞分裂素而只含有一定量生长素的生根培养基中，经诱导生根培养，才能得到完整的组培苗。　　

6.试管苗炼苗处理及移植（假植）生根苗的移栽是组织培养育苗的重要一环，只有移栽成活才能达到快速育苗的目的。　　

花卉试管苗由人工提供各方面优越条件，一般生长发育好，根系也多。可是往往由于没掌握其特性，而造成移栽时成活率不高。　　

这是因为，花卉材料在瓶中处于异养生活状态，可以说比温室生长的花卉还要娇嫩得多。而突然从瓶中移到土壤让其过自养生活，往往由于变化太剧烈而造成损伤甚至死亡。为此，将已生根的瓶苗移出进行炼苗，应注意调控光线与温度。经常调整瓶子位置，使其各个方向均匀受光。2至3天后，可适当旋松瓶盖，使空气慢慢进入，使瓶苗逐步适应自然环境，增强抗逆力。　　

将长到一定大小（5至6片真叶或苗高4至5厘米）、生有4至5条根的组培苗经开瓶炼苗后，洗掉苗上的培养基，将其移栽到保水、透气性好的基质或苗床土中。理想的基质是蛭石，一般为河沙、蛭石、园土等按一定比例混合而成。移栽后的组培苗前期宜生长在适温、适湿的环境中，逐渐使其适应外界环境。　　

炼苗7至10天后进行移植。移植（假植）前，将瓶苗根部的培养基洗净，依大小进行分级。将已分级的瓶苗以沟植或穴植方式植入栽培基质中。移植初期的一周内，应采用塑料薄膜覆盖和用喷雾器浇定根水等措施，以保持湿度，并遮去50％至60％的阳光。试管苗经2至3周驯化后，即可移至培养土中。　　

组培苗由于组织幼嫩，在移植时易滋生杂菌，造成苗霉烂或根茎处腐烂，从而导致死亡。因此可在整个生长期，每间隔7至10天轮换喷一次杀菌剂，如多菌灵、百菌清、甲基托布津等进行预防，而且可以用0.1％多菌灵洗根，并在种植后用它来浇透水，以清除杂菌对首次移栽幼苗的危害。